Bu içerik Geleceği Keşfedenler’den Zeynep Başer tarafından hazırlanmıştır.

Denizanalarının, “Aequorea victoria” gibi bazı türleri floresan protein genlerinin varlığıyla bilinen ilginç ve keskin ışıldama özelliklerine sahip deniz organizmalarıdır. Bu floresan proteinler, denizanalarında mavi ışık filtresi görevi gören açığa çıkarıcılar olarak işlev görür.

Bu yazımda, denizanalarının floresan protein geni ve mavi ışık filtresi arasındaki ilişkisi üzerinde duracağım ve floresan protein geninin nasıl mavi ışık filtresi olarak işlev gördüğünü enformasyon ve deliller ile bilgilerinize sunacağım.

Denizanasındaki yeni floresansın (flüorışı) moleküler temelini belirleme çabaları, 1960’ların başında Osamu Shimomura’nın Aequorea denizanası üzerinde yaptığı çalışmalarla başladı. Denizanasının alt tarafındaki ışıldayan organları içeren dairesel halka çıkarıldığında ve bir iletken geçirildiğinde “sıkmanın” loş bir şekilde ışıldadığını gözlemledi. Binlerce denizanasının toplanıp işlenmesini içeren kahramanca bir çabayla, daha sonra “aequorin” olarak adlandırılan kemilüminesans (kimyasal ışıldama) bir proteini izole edip saflaştırıldı.

Aequorin, mavi ışık emisyonuna (Materyalin yüzeyinin nispi olarak radyasyon ile enerji yayma yeteneğidir) yol açan kalsiyuma bağımlı bir reaksiyonda substrat coelenterata (Denizanalarını içeren bir filumun suda yaşayan omurgasız bir hayvandır.) oksitlenmesini katalize eden bir lusiferazdır. (Biyolüminesansta rol oynayan oksidatif enzimlerin genel adıdır) Fakat gelin görün ki bu keşif bir hayli merak uyandırıcı oldu. Çünkü bozulmamış denizanasının ışıldayan organları, yeşil ışık üretiyordu. Önemli olanın saflaştırma sırasında ultraviyole aydınlatma altında güçlü yeşil floresan gözlemlenmesiydi. Denizanası ekstraktlarında (Ekstraksiyon yöntemlerini kullanarak elde edilen bitki özleridir) oto floresan (Sodyum floresein verilmeksizin gözdeki yapılardan floresan ışıktır) protein bulunduğu ortaya konuldu. Böylece bu otofloresan proteinin, artık denizanası yeşil floresan proteini olarak bilinen kemilüminesan aequorin proteinine eşlik eden bir protein olduğu belirlendi.(GFP)

Prasher tarafından izole edilen klonu kullanan Martin Chalfie, prokaryotlarda (bakteriler) ve Caenorhabditis elegans nematod solucanlarının duyu nöronlarında GFP’yi başarıyla ifade etti ve ilk kez kromofor (Renkli her maddenin rengini veren moleküllerdir) oluşumunun (ve floresansın) denizanasına özgü hiçbir ek faktör gerektirmediğini gösterdi. Bu yeni genetik olarak kodlanmış probun (Bir bileşen yüzeyi ile temas ettiğinde tetiklenmek üzere tasarlanmış, tekrarlanabilir geometrik veriler sağlayan, etkin bir ayrıntılı anahtardır) çeşitli farklı hücresel sistemlerde ve transgenik (Genetiği değiştirilmiş ürünlerdir) organizmalarda in vivo (canlı organizmalarda) floresans etiketlemesi için faydasını gösteren çok çeşitli başka çalışmalar hızla takip edildi.

GFP kromoforunun, birincil amino asit dizisi tarafından kodlandığı ve kendi kendini katalize (Tezgenler kullanarak tepkime hızını artırmadır) eden bir protein katlama mekanizması ve molekül içi yeniden düzenleme yoluyla, kofaktörlere (Biyokimyasal dönüşümlere yardımcı olan yardımcı moleküllerdir) veya harici enzim bileşenlerine (moleküler oksijen dışında) ihtiyaç duymadan kendiliğinden oluştuğu ortaya çıktı. Böylece, genetik olarak kodlanmış GFP, ilk kez, ekzojen sentetik veya antikor etiketli floresan etiketlere ihtiyaç duymadan canlı hücre içindeki spesifik proteinleri etiketleme yeteneğini sağladı.

Saflaştırılmış proteinin papain ile sindirimi ve ardından parçaları izole etmek için yüksek performanslı sıvı kromatografisi, GFP’nin tüm ışık emme özelliklerinden amino asit 64’te başlayan tek bir heksapeptid dizisinin sorumlu olduğunu ortaya çıkardı. Bu keşif, aequorinden mavi ışık enerjisini emen kromoforun, bitişik serin(65)-dehidrotirozin(66)-glisin(67)’nin siklizasyonuyla oluştuğunun gösterilmesine yol açtı; sayı, bozulmamış peptit (α-amino asitlerin birbirine bağlanmasıyla oluşan kısa polimerlerdir.) dizisindeki amino asit pozisyonunu belirtir. Şekil 1’de  heksapeptid dizisi içindeki kalıntılar görülebilir.

Mavi Floresan Proteinler

WtGFP’den türetilen en eski renk varyantlarından biri, Tyr66’nın histidin (Y66H) ile ikamesini içeren mavi floresan proteindir (BFP). Y66H mutasyonu, 380 nanometreye yakın merkezli geniş bir emme bandına sahip olan ve mavi ışık emisyonunun 448 nanometrede zirve yaptığı bir kromofor üretti (Şekil 1). BFP’nin orijinal versiyonu düşük bir kuantum verimine sahiptir ve ana wtGFP’nin parlaklığının yalnızca yaklaşık yüzde 15 ila 20’sini sergilenmiştir. Dolayısıyla floresan proteinin özelliklerini geliştirmek için ek mutasyonlara açıkça ihtiyaç vardır. Bu mutasyonların eklenmesi EBFP varyantının oluşmasına yol açtı. Ancak bu türev hala EGFP’nin yalnızca yüzde 25’i kadar parlaktı ve hücresel bir işaretleyici olarak kullanımı, zayıf fotostabilite nedeniyle ciddi şekilde sınırlıdır. BFP ayrıca, EGFP’ye doğrudan füzyon olarak ilk genetik olarak kodlanmış biyosensör raportör proteinlerine dahil edilme ayrıcalığına sahiptir. BFP’nin geniş emisyon zirvesi, EGFP’nin absorpsiyon bandıyla önemli ölçüde örtüşür ve bu çiftin FRET mikroskobunda kullanılmasına olanak tanır. EBFP’nin müdahale eden bir proteaza duyarlı aralayıcı yoluyla EGFP’ye bağlanması, FRET’in biyosensör proteininin bölünmesini göstermek için kullanılmasına izin verdi.

En kullanışlı Aequorea bazlı floresan protein varyantlarının özelliklerinin bir derlemesi Tablo 1’de sunulmaktadır. Her bir floresan proteinin ortak adı ve/veya kısaltmasının yanı sıra, tepe uyarma (Ex) ve emisyon (Em) dalga boyları, molar yok olma katsayısı (EC), kuantum verimi (QY), göreceli parlaklık, fotostabilite (Güneş ışığı altında dayanıklı kalma becerisidir) ve fizyolojik olarak ilgili dörtlü yapı listelenmiştir (Zayıf bir dimer anlamına gelir). Hesaplanan parlaklık değerleri, molar sönme katsayısı ve kuantum veriminin çarpımının EGFP değerine bölünmesiyle elde edildi. Bu liste bilimsel ve ticari literatür kaynaklarından oluşturulmuştur ve kapsamlı olması amaçlanmamıştır; bunun yerine literatürde büyük ilgi gören ve araştırma çabalarında değerli olabilecek floresan protein türevlerini temsil etmektedir. Listelenen uyarılma ve emisyon tepe değerleri, geniş spektral profiller nedeniyle yayınlanan raporlarda farklılık gösterebilir. Gerçek floresan mikroskobu araştırmalarında, belirli bir floresan proteinin deneysel parlaklığı, bu tabloda sağlanan parlaklıktan (göreceli olarak) farklı olabilir.

Son zamanlarda birkaç grup, çok daha yüksek kuantum verimi ve fotostabiliteye sahip yeni BFP varyantları geliştirmek için ileri mutajenez stratejilerini kullandı. Bu koyu mavi probların kullanımını büyük ölçüde artırıyor. Bu varyantlara Azurit adı verilir. SBFP2 (kuvvetle geliştirilmiş mavi floresan protein) ve EBFP2. En umut verici türev olan EBFP2, şimdiye kadar keşfedilen BFP varyantlarının en parlak ve ışığa en dayanıklı olanıdır ve FRET çalışmaları için mükemmel bir donör olduğu gösterilmiştir. EBFP2, mavi bir probun gerekli olduğu durumlarda, özellikle de ultraviyole yakın uyarımla hücresel hasarı önleyen iki fotonlu uyarım kullanıldığında, canlı hücreleri kullanan uzun vadeli görüntüleme için yararlı olmalıdır.

Sonuç olarak, denizanalarını floresan protein geni, mavi ışığı emme ve yeşil ışığı yayma yetenekleri sebebiyle mavi ışık filtresi olarak işlev görebilmektedir. Bu protein yapısı olan Floresein mavi ışığı emip yeşil ışığı yayma özelliği gösterir. Bu özellikler denizanalarının floresan proteini geni ve mavi ışık filtresi arasındaki ilişki, gelecekteki araştırmalar için birçok yeni keşfin önünü açar.

Unutmayın ki;

Araştırma, herkesin baktığına bakmak ve kimsenin görmediğini görmektir.

Kaynaklar:

1. https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/highlighterfps.html
2. Proteins that glow in green and blue – CORE https://core.ac.uk/download/pdf/82458581.pdf
3. The Nobel Prize in Chemistry 2008 – Popular information – NobelPrize.org https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/popular-information/
4. http://publications.rwth-aachen.de/record/49863/files/Lantin_Corinna.pdf
5. https://www.thermofisher.com/tr/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/imaging-basics/labeling-your-samples/labeling-using-fluorescent-proteins.html
6. https://www.shimadzu.co.jp/boomerang/20/09.html